Les tests moléculaires visent à analyser un ou plusieurs gènes particuliers afin d’y rechercher la ou les mutations responsable(s) de la maladie.

Dès lors qu’un gène est identifié comme étant impliqué dans une maladie, la recherche des mutations est rendue possible par la comparaison de la séquence du gène chez des patients avec la séquence « normale » ou « de référence » de ce gène.

Ce n’est pas la totalité du gène que l’on analyse, mais généralement uniquement les portions codant pour la protéine (appelées exons) et lorsqu’elles sont connues (ce qui est encore loin d’être le cas général) les séquences régulant l’expression du gène.

Pour ce faire, l'ADN du patient peut être extrait à partir de toute cellule contenant un noyau, et des mitochondries dans le cas des maladies mitochondriales. Classiquement, l'ADN est isolé à partir des globules blancs, qui sont obtenus à partir d'un simple prélèvement sanguin (5 à 10 millilitres de sang suffisent).
Dans le cas d'un diagnostic prénatal, l'ADN du fœtus pourra être extrait soit à partir de cellules du liquide amniotique soit à partir d'un prélèvement de trophoblastes (cellules placentaires d’origine fœtale).
Différentes techniques sont utilisées, en fonction de la nature des mutations à rechercher et de la taille du gène à analyser.

Il n’y a en effet pas de règle générale, chaque maladie, chaque gène à étudier, se présentant d’une certaine façon comme un cas particulier. La variété des situations peut être illustrée ainsi :

• certains gènes sont de petite taille et ne possèdent que quelques exons (gène de la connexine 32 responsable de la maladie de Charcot-Marie-Tooth liée au chromosome X), d’autres en possèdent plusieurs dizaines ou centaines (gène CFTR responsable de la mucoviscidose ; gène de la dystrophine, responsable de la myopathie de Duchenne) ;

• dans certaines maladies c’est toujours la même mutation, ou un nombre très restreint de mutations, qui est responsable (cas de l’anémie falciforme ou de la maladie de Steinert) ; dans d’autres on peut trouver une ou plusieurs mutations majoritaires associée(s) à de très nombreuses autres mutations (mucoviscidose avec une mutation qui représente 65% des cas, et plus de 1000 autres mutations connues) ; enfin dans d’autres maladies chaque malade présente une mutation différente ;

• dans la plupart des cas, un seul gène doit être analysé, mais parfois plusieurs gènes doivent l’être.

On comprend bien que les stratégies d’analyse ne seront pas les mêmes selon les cas de figure, et que le temps requis pour obtenir le résultat pourra varier de quelques jours à quelques semaines ou mois.

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