L’ADN étant le support des informations indispensables à la vie de la cellule, il est protégé au plus profond de la cellule, à l’intérieur de son noyau. L’ADN n’est donc pas disponible directement pour les diverses analyses génétiques, c’est pourquoi nous passons par l’étape d’extraction d’ADN.

Le but de cette extraction va être d’isoler l’ADN des autres composés de la cellule.

 

Nous allons prendre l’exemple d’une extraction d’ADN à partir de sang pour illustrer les différentes étapes.

Lavage

Cette première étape consiste à éliminer les globules rouges ainsi que toutes les impuretés du milieu extracellulaire. Ce lavage se fait par ajout d’une solution hypotonique qui aura pour effet de faire éclater les globules rouges mais pas les globules blancs qui eux sont beaucoup plus résistants.

Les globules rouges ne contenant pas d’ADN, il sera extrait des globules blancs.  

Centrifugation

La centrifugation va séparer les globules blancs des débris de globules rouges.

A la fin de la centrifugation on peut voir au fond du tube un « culot » blanc (globules blancs) et un surnageant rouge (débris de globules rouges) qui est retiré du tube. La centrifugation se fait à la vitesse de 4000 rpm (rotation par minute) pendant 5 minutes.

Ces 2 premières étapes sont réalisées jusqu’à obtenir une solution au dessus du « culot » limpide.

Destruction des globules blancs ou lyse des blancs

On utilise pour cette étape une solution agressive de détergeant qui va déstabiliser la membrane des globules blancs et le noyau de la cellule. On ajoute une enzyme appelée « protéinase K » qui va dégrader les protéines de la cellule. Pour avoir une activité optimale de la protéinase K le tube est chauffé entre 55 et 65 °C de 1 heure à toute une nuit.

Après cette étape le tube d'extraction contient un mélange d'ADN et les restes de la cellule, fragments de protéines, résidus de la membrane de la cellule et toutes les molécules du cytoplasme.  

Précipitation de l’ADN

La précipitation a pour but de séparer l'ADN du reste de la solution de lysat. L'étape va consister à ajouter délicatement de l'isopropanol pur (dit isopropanol 100%) et mélanger le tube délicatement. Au bout de 4 à 5 agitations, il se forme une masse opaque appelée « pelote » qui n'est autre que l'ADN.

Elimination de la solution de lyse

La centrifugation va mettre la pelote d'ADN au fond du tube. Il sera alors possible d'éliminer le surnageant contenant les restes de la cellule sans toucher à l'ADN.

Lavage à l'éhanol 70%

Pour être sûr d'éliminer le maximum de la solution de lyse, on ajoute dans le tube de l'éthanol 70%. L’éthanol 70 % éliminera mieux les restes de la solution de lyse que l’isopropanol car il contient 30% d’eau. L’eau solubilisera les impuretés  autour de la pelote d’ADN. L'échantillon est agité pour laver au mieux la pelote. Le tout est centrifugé à 4000 rpm pour mettre la pelote au fond du tube et éliminer le surnageant.

Séchage

L'éthanol peut altérer les analyses qui seront réalisées sur cet ADN. Le tube va être laissé ouvert pour que l'éthanol s'évapore.

Hydration de l'ADN

L'ADN en pelote sèche ne peut pas être utilisé pour les analyses de biologie moléculaire. Il faut que l'ADN soit réhydraté dans une solution. L’ADN sera totalement réhydraté lorsque la pelote aura disparu. La solution est le plus souvent du TE pour Tris-EDTA. Ces composés donnent un pH et une force ionique à l'eau optimisant l'hydratation et la conservation de l'ADN. Pour une meilleure hydratation de l'ADN le tube est chauffé à 65°C pendant 1 à 2 heures après l'ajout du TE.

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